Разработка ферментативных гидролизатов сывороточных белков молока - технологии, свойства и применение

Первоначально сырьём для получения гидролизатов выбраны термокоагулированные сывороточные белки (ТСБ), полученные способом термокислотной коагуляции. ТСБ, известные под названием альбуминной или белковой массы, характеризуются низкими функциональными свойствами (растворимость, жироэмульгирование, пенообразование) и невысокими потребительскими свойствами (специфический альбуминный вкус и запах, крупитчатость). В то же время этот продукт является источником биологически ценного пищевого белка, не уступающего по аминокислотному скору казеину и яичному белку. В последние годы акцент исследований смещён в направлении нативных сывороточных белков, как более функциональной и технологичной формы белкового субстрата для ферментативного гидролиза.

Для получения термокоагулированных и нативных сывороточных белков используются разные способы разделения и концентрирования белкового компонента сыворотки, которые могут оказывать влияние на фракционный состав получаемого концентрата. С применением гель-фильтрации высокого разрешения на Superose 12 изучен фракционный состав двух видов белковых концентратов - КТСБ и изолята сывороточных белков с одинаковым содержанием белков.

На рис. 1 представлена хроматограмма подсырной сыворотки, являющейся сырьём для получения ТСБ и нативных сывороточных белков. ТСБ состоят из полностью денатурированных, лишеных глобулярной структуры и нерастворимых в воде белков. Белковый состав ТСБ можно косвенно оценить путем сравнения фракционного состава сыворотки до и после термокислотной коагуляции белков (рис. 1 и рис. 2).

Из рисунков видно, что после термокислотной коагуляции белков в сыворотке остаются протеозо-пептоны и низкомолекулярные азотистые соединения. Фракции иммуноглобулинов, бычьего сывороточного альбумина, β-лактоглобулина и α-лактальбумина денатурируют, теряют глобулярную структуру и хроматографически не определяются. Часть белков коагулирует и переходит в осадок. Таким образом ТСБ представлены термокоагулированными формами белковых фракций (преимущественно β-лактоглобулином и α-лактальбумином).

Способом ультрафильтрации и диафильтрации получают концентраты и изоляты нативных сывороточных белков (КСБ). На рис. 3 представлена хроматограмма КСБ-80, содержащего 80 % белков. Из рисунка видно, что нативные белки представлены в основном фракциями β-лактоглобулина и α-лактальбумина, количество иммуноглобулинов и бычьего сывороточного альбумина незначительно, по сравнению с исходной сывороткой. По-видимому, часть этих термолабильных белков денатурировала.

Рис.1 – Хроматограмма подсырной сыворотки

1 - иммуноглобулины; 2 - бычий сывороточный альбумин; 3 - β-лактоглобулин;

4 - α-лактоальбумин; 5 - протеозо-пептоны; 6 - <2200 Да

Рис.2 – Хроматограмма подсырной сыворотки после термокислотной

коагуляции белков

1 - протеозо-пептоны; 2 - <2200 Да

Рис.3 – Хроматограмма КСБ-80

1 - иммуноглобулины; 2 - бычий сывороточный альбумин;

3 - β-лактоглобулин; 4 - α-лактоальбумин

Таким образом, ТСБ и КСБ-80 представлены одними и теми же фракциями сывороточных белков и отличаются их соотношением и конформационным состоянием. Форма сывороточных белков может оказывать существенное влияние на ферментативный гидролиз.

ГНУ ВНИИМС разработаны гидролизаты ТСБ технического и пищевого назначения. Гидролизаты технического назначения используются в качестве белковой основы - источника азота питательных сред для диагностики и культивирования бактерий и культур клеток. Гидролизаты пищевого назначения - источники белкового питания человека в тех случаях, когда нативный белок из-за физиологических нарушений организма не усваивается или вызывает патологические реакции.

Лактопептон бактериологический сухой представляет первую разработку ГНУ ВНИИМС в области гидролиза сывороточных белков. Лактопептон применяется в качестве белковой основы широкого спектра микробиологических питательных сред, используемых для микробиологического контроля на предприятиях молочной отрасли и других пищевых производств. Лактопептон производится на опытном производственном участке ГНУ ВНИИМС в течение 20 лет. Исходным сырьём является подпрессованная альбуминная масса с м. д. сухих веществ не менее 20 %. Ключевым этапом в технологии лактопептона является стандартизация белкового сырья для гидролиза. Технология получения альбуминной массы предусматривает подкисление подсырной сыворотки кислой сывороткой, термическую коагуляцию и выделение сывороточных белков. При высоком содержании молочной кислоты в альбуминной массе невозможно получить гидролизат высокого качества вследствие отрицательного влияния лактата натрия, образующегося при раскислении реакционной смеси для поддержания оптимального рН, на выход продукта (снижается на 10-15 %), цвет (становится коричневым) и остаточную влажность (м.д. влаги ≥ 9 %, сопровождаемая сильной комкуемостью) сухого гидролизата. Для получения качественного продукта отбирают альбуминную массу, полученную из сладкой, сыворотки с кислотностью не выше 21 °Т. При высоком содержании молочной кислоты (рН ниже 5,0) альбуминную массу промывают водой для удаления молочной кислоты, а к суспензии промытых белков добавляют богатую ростовыми факторами сухую сыворотку. Гидролиз проводят комплексом протеаз поджелудочной железы животных. Оптимальная глубина гидролиза белкового субстрата, обеспечивающая получение профиля наиболее ценных для метаболизма бактерий продуктов гидролиза (полипептидов, пептидов и аминокислот) составляет 25 - 30 % По окончании процесса гидролизат нагревают для лучшей коагуляции нерасщепленного белка и инактивации ферментов, фильтруют до прозрачности, фильтрат концентрируют и высушивают распылением. Лактопептон представляет собой сыпучий, тонкодисперсный порошок, цвет - от светло-желтого до светло-коричневого, с характерным запахом, содержит влаги –7,0 %, азотистых веществ - 68,3 %, в том числе пептидов – 38,6 %, свободных аминокислот – 29,7 %, лактозы – 7,5 % (таблица 1). Пептидная фракция представлена незначительной долей полипептидов, фракциями среднемолекулярных и  низкомолекулярных пептидов. Лактопептон является белковой основой большинства питательных сред для определения бактерий группы кишечной палочки (Кесслер, Эндо, глюкозо-пептоная среда и др.), которые производит и поставляет на молочные предприятия ГНУ ВНИИМС.

Таблица 1 – физико-химические свойства лактопептона и ГСБМ

Гидролизат сывороточных белков молока (ГСБМ) с глубокой степенью гидролиза (не менее 60 %) предназначен для использования в качестве основы питательных сред тканевых культур и разработан для замены импортного гидролизата лактальбумина (ГЛА). Для его получения отбирают сырьё высокого качества – прессованную альбуминную массу с м.д. сухих веществ 32-33 %, рН не ниже 6,0 и содержанием жира не более 1-2 %. ГСБМ получают путем гидролиза ТСБ комплексом протеаз поджелудочной железы свиньи, характеризующимся максимальным расщепляющим эффектом. Гидролизат очищают от нерасщепленного белкового остатка фильтрацией, водорастворимые продукты гидролиза концентрируют под вакуумом, концентрат высушивают распылением. Сухой продукт представляет собой сыпучий, тонкодисперсный порошок светло-желтого цвета, с запахом, характерным для белковых гидролизатов, содержит влаги –6,0 %, азотистых веществ - 79,7 %, в том числе свободных аминокислот –  49,0 %, пептидов – 31,0 %, лактозы – 8,5 %. ГСБМ является основой питательных сред для культивирования клеток, вирусов и тканевых культур взамен импортного гидролизата латальбумина (ГЛА). Преимуществом ГСБМ является возможность длительного культивирования диплоидных и перевиваемых линий клеток животных.

Технология ГСБМ взята за основу при получении белкового гидролизата лечебно-профилактического назначения, получившего название «Амилакт». Особенностью технологии этого вида продукта является дополнительная очистка белкового сырья от небелковых примесей (лактозы, солей), оптимизация режимов гидролиза (использование комплекса протеаз поджелудочной железы крупного рогатого скота и протеолитического ферментного препарата Flavourzyme 1000 L) и рафинация гидролизата с целью улучшения органолептических показателей готового продукта. Сухой продукт близок по физико-химическим свойствам ГСБМ, и незначительно отличается от последнего по составу азотистых фракций (незначительно снижена доля свободных аминокислот). «Амилакт» полностью растворим в воде, водные растворы гидролизата с м.д. сухих веществ 5-6 % имеют мягкий, солоноватый вкус с легким бульонным оттенком. Проведены клинические испытания гидролизата в медицинских учреждениях для лечения и реабилитации больных с различной степенью белково-энергетической недостаточности. Установлено положительное влияние при комплексном лечении хронического гепатита, ишемической болезни сердца, гипертонической болезни, сахарного диабета, дисбактериоза и синдрома раздраженного кишечника.

Последняя разработка ГНУ ВНИИМС - гидролизат сывороточных белков молока (ГСБМ) сухой гипоаллергенный. Сырьё – альбуминная масса, полученная из сладкой подсырной сыворотки сыворотки с кислотностью не выше 21°Т  подвергнутая дополнительной промывке водой до максимального удаления лактозы, молочной кислоты и солей. Подготовленная таким образом альбуминная масса характеризуется высоким содержанием белков (85,0-88,0 % в пересчете на сухой вес), пониженной массовой долей золы (не более 2 %) лактозы (не более 1 %). Гидролиз проводят комплексом ферментов, включающим протеазы поджелудочной железы животных, эндопротеазы и экзопептидазы микробного происхождения Protamex и Flavourzyme (Novozymes A/S, Дания). Включение экзопептидаз обязательно для снижения горького вкуса гидролизата. ГСБМ гипоаллергенный представляет собой сыпучий тонкодисперсный порошок высокой растворимости (99,8 %). Массовые доли влаги, общего азота, азота аминогрупп аминокислот и низкомолекулярных пептидов, золы и лактозы в гидролизате, выработанном по оптимальному варианту составили соответственно (%):3,97±0,30; 12,33±0,06; 5,60±0,27; 3,23±0,60 и 2,13±0,06. Методом гель-фильтрации высокого разрешения выявлено три области белковых веществ с молекулярными весами более 4,5 (31,1±7,8 %), от 1,7 до 4,5 (21,48±5,46 %) и менее 1,7 (50,4±6,4 %) кДа. По данным НИИ питания остаточная антигенность гидролизата в 17000 раз ниже нативных сыворточных белков. Гидролизат испытан по органолептическим показателям в составе рецептур детского питания в НИИДП, получены удовлетворительные результаты. НИИДП разработал продукт для питания школьников «Спортивный», в рецептуру которого входит ГСБМ гипоаллергенный.

ГНУ ВНИИМС продолжает исследования в области гидролиза ТСБ с целью совершенствования разработанных технологий. Однако использование ТСБ как белкового сырья ограничено в тех случаях, когда необходимо получить гидролизат с узким диапазоном молекулярных масс способом мембранного разделения,

Преимуществом мембранных методов разделения является возможность формирования заданного состава пептидных фракций в зависимости  от назначения гидролизата. Совмещая мембранные методы разделения с ферментативным гидролизом нативных сывороточных белков можно получать гидролизаты, обогащённые функционально активными    пептидными фракциями. ГНУ ВНИИМС проводит исследования по гидролизу нативных сывороточных белков, готовит экспериментальную базу для реализации процессов гидролиза и мембранного разделения и планирует проведение широких исследований в этом направлении для разработки гидролизатов функционального назначения, включая лечебно-профилактические и продукты здорового питания.

Абрамов Д.В., Свириденко Ю.Я., Мягконосов Д.С., Овчинникова Е.Г., Кангин М.П., Кокарева Н.В.

ГНУ ВНИИ маслоделия и сыроделия Россельхозакадемии