Вторичное соотношение полов и ранние этапы эмбриогенеза у крупного рогатого скота

Ни у одного вида млекопитающих при рождении нет равного количества самцов и самок. При этом общеизвестно, что самцов рождается больше, чем самок [6]. 

В то же время, в животноводстве половые различия рождаемых животных могут иметь существенную важность в случае преобладания экономического значения одного пола над другим. В частности, у молочного скота главный хозяйственный признак, – молочная продуктивность, – ограничен полом. 

В настоящее время на практике достаточно широко используется метод эмбриотрансфера - трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Одно из его наиболее существенных отличий от естественного процесса эмбриогенеза – массовое образование яйцеклеток, с чем, вероятно, связано несоответствие первичного и вторичного соотношения полов при рождении потомства у крупного рогатого скота.

Возможность в результате полиовуляции одномоментного получения массового числа доимплантационных зародышей дает в руки исследователей обширный материал по изучению развития эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза. Поэтому вопрос, каким будет соотношение полов у эмбрионов после суперовуляции, и какие факторы принимают участие в регуляции этого соотношения, представляет особый интерес. 

В результате анализа наших многолетних практических исследований в области биотехнологии эмбриотрансфера у крупного рогатого скота [1, 2, 3] были получены данные о том, что вторичное соотношение полов у потомства нестабильно и находится в зависимости от процессов, происходящих на ранних этапах эмбриогенеза.

Сначала мы провели анализ разницы в соотношении пола при рождении телят зависимости от возраста доимплантационных эмбрионов. 

Результаты приведены в таблице1. В качестве реципиентов использовались телки черно-пестрой породы. В качестве доноров эмбрионов коровы 5 пород (голштинская, симментальская, герефордская, лимузинская, абердин-ангусская), но порода коров во внимание не принималась. Без учета стадии развития эмбрионов из 1093 учтенных отелов бычками растелились 564, а телочками – 529 голов, что составляло 51,6 и 48,4% соответственно. Таким образом, при трансплантации эмбрионов бычков рождалось на 3,2% больше, чем телочек. 

В то же время, анализ результатов пересадки эмбрионов на разных стадиях развития привел к неожиданным результатам. 

Так, при пересадке реципиентам 7-дневных морул преимущество рождения бычков по отношению к телочкам изменялось в еще большей степени – из 665 отелов на долю бычков пришлось 367, или 55,2%, а на долю телочек 298, или 44,8%, то есть бычков на 10,4% больше.

При пересадке 8-дневных бластоцист, то есть эмбрионов, прошедших стадии развития от зиготы до формирования бластоцисты, был зафиксирован «зеркальный» результат. Соотношение изменялось в противоположную сторону – бычков рождалось меньше, чем телочек на 8% - из 428 стельных реципиентов бычками растелилось 197 голов (46 против 54%).

Таким образом, при пересадке морул бычков рождалось на 9,2% больше, чем при пересадке бластоцист - 55,2 против 46% (разница высоко достоверна при Р <0,001). 

Как видно из полученных данных, различия во вторичном соотношении полов при рождении телят не согласуются с теорией равновероятного образования мужских и женских особей при первичном соотношении полов. Результаты пересадки эмбрионов на разных стадиях развития показывают, что изначально мужских эмбрионов образуется больше, чем женских, по неизвестным пока факторам. Причина, вероятно, кроется непосредственно в процессе оплодотворения и последующих этапах эмбриогенеза.

Давно известно, что у млекопитающих отмечается неравенство в продолжительности жизни в пользу самок.

Это неравенство прослеживается как у взрослых особей, так и в утробе матери – зародыши мужского пола погибают чаще. Однозначного ответа на вопрос о причинах такого неравенства пока нет. Но очевидно, что суть проблемы в генетическом различии полов. 

Вся генетическая информация хранится в хитроумно скрученных молекулах ДНК. В организме все хромосомы в парах. Каждую пару образуют две одинаковые хромосомы. Но есть одно исключение: та пара, которая определяет пол. У самок половые хромосомы одинаковые (ХХ), а у самцов – разные (ХУ).

Существует группа генетических заболеваний, сцепленных с полом. Им подвержены почти исключительно самцы, что связано с «поломками» в половых Х- и У-хромосомах самцов. 

Почему дефекты в половых хромосомах сильнее бьют по самцам? У самок У-хромосома попросту отсутствует, а Х-хромосома парная, и поломка в одной из них обычно компенсируется наличием здорового гена в другой хромосоме: здоровый ген, если он доминантный, не позволяет дефектному проявить себя. Сама по себе непарность половых хромосом – причина уязвимости организма самцов.

Поскольку у мужских эмбрионов аномалии или дефекты на генетическом уровне встречаются чаще, соответственно и избирательный апоптоз, или гибель среди них в организме матери выше, чем у женских эмбрионов. Казалось бы, в этом случае возможность рождения потомков мужского пола существенно снижается. 

В то же время известно, что для животных, у которых гетерогаметны самцы, в том числе крупный рогатый скот, возможно разделение сперматозоидов на две фракции – с X- и Y-хромосомой, что основано на их разнице в массе [3, 4, 9]. Спермии с Y-хромосомой имеют меньшую массу и величину. Так, средний размер X-хромосомы крупного рогатого скота составляет 6,17 мкм, а Y-хромосомы – 2,22 мкм. Вероятно, сперматозоиды с Y-хромосомой по причинам, связанным с меньшей массой, обладают большей оплодотворяющей активностью, чем сперматозоиды с X-хромосомой [4]. Исходя из этого, мужских зигот в процессе оплодотворения яйцеклеток образуется больше, чем женских. 

В технологии эмбриотрансфера, при получении эмбрионов in vivo, в результате полиовуляции образуется повышенное количество яйцеклеток. После их оплодотворения, как следует из вышесказанного, число мужских зигот будет превалировать над женскими. Однако, в результате нейрогуморальной и биохимической регуляции на следующих этапах эмбриогенеза проявляется эффект избирательного отсева зародышей с генетическими дефектами. Значит отсеву в большей степени подвержены эмбрионы мужского пола. Такой «принцип компенсации», заложенный, вероятно, в репродуктивной эволюции популяции на уровне генома женских особей, стремится к выравниванию соотношения разнополовых эмбрионов к моменту нидации в слизистую матки.

Целенаправленный отсев патологий в эмбриогенезе - процесс, который вступает в силу к моменту оплодотворения, начинается с отбраковки аномальных гамет (яйцеклеток и сперматозоидов), затем на уровне зигот и ранних эмбрионов, и продолжается вплоть до нидации бластоцисты после хэтчинга. На раннем этапе эмбриогенеза работает, так называемый, «блок развития» (остановка дробления бластомеров с последующим апоптозом эмбриона), который изначально препятствует появлению потомства с генетическими патологиями в будущем. При этом сначала отсеиваются хромосомные аномалии, неприемлемые для жизни организма, затем неприемлемые в меньшей степени, и так происходит до тех пор, пока наследуемость генетических отклонений в геноме эмбриона перестает быть критичной для эволюционного развития популяции того или иного вида живых организмов, в нашем контексте, крупного рогатого скота. Вероятно, этот процесс становится минимальным ко времени формирования зрелой бластоцисты и ее имплантации в слизистую матки.  

Действительно, в трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота при морфологическом определении качества эмбрионов, признаки дегенерации наиболее часто встречаются среди морул, извлеченных из матки коровы-донора на 6-7 день индуцированного полового цикла. Это является признаком отбраковки их организмом матери и невозможности дальнейшего развитии до стадии бластоцисты. Но следует отметить, что этот процесс продолжается и приводит к апоптозу лишь в случае, когда развитие таких эмбрионов продолжается в матке истинной матери, коровы-донора. Однако, после их изъятии из матки уже в течение нескольких часов происходит регенерация зародышевых клеток и восстановление способности к тотипотентному развитию.  

Здесь мы сталкиваемся со следующим противоречием. Исходя из вышесказанного следует ожидать, что повторное возвращение эмбрионов в состоянии частичной дегенерации в среду матки, что происходит после пересадки реципиентам, должно привести к возобновлению процесса отторжения и стельность наступить не может. Но этого не происходит, поскольку практика пересадки таких эмбрионов показывает успешные результаты [1, 2, 3, 5, 8].

Почему не возобновляется процесс дальнейшей дегенерации у поврежденных эмбрионов, когда после пересадки они вновь попадают в среду матки, где им должен противостоять «блок развития»? Вероятно, достаточно убедительным объяснением будет следующее. Если у истинной матери присутствует механизм остановки дробления с последующей дегенерацией части собственных эмбрионов, то, вероятно, у реципиента, или суррогатной матери, такой механизм по отношению к неопознанным, или чужеродным эмбрионам, отсутствует.

При морфологической оценке эмбрионов, находящихся в состоянии не полной дегенерации, в хаотичном распаде клеток зародышевого комплекса обычно выделяется группа живых клеток менее объема полноценного комплекса. При повреждениях бластомеров более 50%, такой, частично дегенерированный эмбрион, называют условно пригодным. 

Результаты трансплантации условно пригодных эмбрионов приведены в таблице 2.

При пересадке одного условно пригодного эмбриона приживляемость была достоверно (Р<0,01) ниже, чем одного отличного эмбриона – 32,5 против 53,7% соответственно. Тем не менее это достаточно высокий показатель, который безусловно подтверждает тенденцию к регенерации и восстановлению развития поврежденных эмбрионов.

Показана разница в уровне стельности от пересадки одного условно пригодного эмбриона против двух условных или отличных эмбрионов, и была достоверно ниже: 32,5 против 56,2 и 59,8% соответственно (Р <0,01; 0,001), что было ожидаемым.

Здесь следует отметить, что пересадка 2 условно пригодных или 2 отличных эмбрионов обеспечивала практически одинаковый уровень стельности - 56,2 и 59,8%. Сам факт выравнивания значений этого показателя является прямым подтверждением полного восстановления гомеостатического потенциала и тотипотентности развития у дефектных эмбрионов. 

Доказательством устойчивости тотипотентного развития и высокой резистентности эмбрионов в экстремальных условиях (вне организма матери), может служить такой эпизод из нашей практики. У 7-дневной морулы, извлеченной у коровы-донора по технологии in vivo, в результате лабораторных манипуляций была повреждена зона пеллюцида и зародышевый комплекс эмбриона, лишенный прозрачной оболочки, был поставлен на культивирование. Через 24 часа морула в отсутствие внешней защиты достигла стадии зрелой бластоцисты, которую пересадили телке-реципиенту. Через два месяца была установлена стельность и в положенный срок родилась жизнеспособная телочка.

В наших экспериментах процедура культивирования рассматривается не только как создание благоприятных условий для роста, но и в ракурсе фактора, стимулирующего развитие доимплантационных эмбрионов, в том числе поврежденных, находящихся в процессе дегенерации.

На представленных фото (рис. 1) наглядно продемонстрированы результаты культивирования эмбрионов, находившихся в состоянии дегенеративных изменений, которые могли бы привести к полному апоптозу при дальнейшем нахождении их в материнском организме. 

После извлечения из матки 12 морул с дегенеративными изменениями в форме лизиса части бластомеров при отсутствии полной компактизации, что говорит о нарушениях связей между бластомерами, были поставлены на культивирование. 

Рис. 1. 

Культивирование доимплантационных эмбрионов в состоянии 

дегенерации - восстановление тотипотентного развития

вне материнского организма

1. 2.

Фото 1 – до культивирования

16 ранних морул в возрасте 6 дней, из которых: 12 – частичная дегенерация и отсутствие компактизации – поставлены на культивирование; 4 – остановка дробления, апоптоз.

Фото 2 – через 36 часов после культивирования

12 морул в возрасте 7,5 суток, из которых: 9 – зрелые и экспандированные бластоцисты; 3 – апоптоз.

Через 36 часов после культивирования 9 эмбрионов развились до стадий зрелых и экспандированных бластоцист, у 3 эмбрионов дробление прекратилось, и они подверглись апоптозу.  Таким образом, в ходе эксперимента 75% морул (9 из 12) в состоянии дегенерации полностью восстановились до полноценных бластоцист через 1,5 суток культивирования.

 Полученные результаты однозначно подтверждают сделанные нами выводы о возможности остановки процессов распада, спровоцированных «блоком развития» у матери, и восстановлению тотипотентного развития таких эмбрионов вне материнского организма.

Остается вопрос, способны ли бластоцисты, восстановленные в процессе культивирования из повреждённых морул, к имплантации и последующему эмбриогенезу в организме приемной матери.

Ответом являются результаты наших экспериментов по пересадке. Нескольким группам реципиентов была проведена трансплантация зрелых бластоцист, восстановленных в процессе культивирования из условно пригодных морул (смотреть выше). В сравнительном аспекте мы использовали данные длительных экспериментов по пересадке интактных 7-8-дневных эмбрионов, проведенных в других группах реципиентов. В обоих случаях в качестве реципиентов использовались телки случного возраста (таблица 3).  

В результате отелов реципиентов, ставших стельными после пересадки прокультивированных эмбрионов, было получено 68 телят (к сожалению, данные по количеству пересадок утеряны).

 Как сами отелы, так жизнеспособность телят и их физиологическое состояние, были в пределах нормы и ничем не отличались от аналогичных показателей у сверстников, полученных в группах по пересадке интактных эмбрионов. 

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности эмбрионов после культивирования к тотипотентному развитию в организме приемной матери.

Особого внимания заслуживает анализ половых различий в полученном потомстве. Как оказалось, соотношение бычков и телочек в группах по пересадке различных эмбрионов отличалось кардинально. Здесь мы снова возвращаемся к вопросу о вторичном соотношении полов. 

В результате 68 отелов родилось 46 бычков и только 22 телочки, что составило 67,6 и 32,3% соответственно. 

Таким образом, 67,6% эмбрионов, которые были отбракованы и подверглись дегенерации в организмах коров-доноров, были мужского пола, и только 32,3% женского, что в высокой степени согласуется с выводами исследований, представленными нами выше. Это, безусловно, подтверждает заключение о том, что после оплодотворения яйцеклеток, мужских зигот, а затем и эмбрионов, образуется больше, чем женских. В то же время, они в большей степени подвергаются отторжению, как более частые носители генетических отклонений. 

Здесь мы видим достаточно убедительное объяснение несоответствию между первичным и вторичным соотношениями полов. Существующее несоответствие не может быть величиной постоянной, поскольку зависит от случайного фактора – количества и значимости генетических аномалий у эмбрионов. Поэтому и разница в соотношении пола у потомства при рождении будет постоянно варьировать.

Итогом представленной работы по вопросу несоответствия между первичным и вторичным соотношением полов могут служить следующие выводы, сделанные нами на основе данных теоретических и экспериментальных исследований в области биотехнологии эмбриотрансфера у КРС.

Выводы: 

- после оплодотворения яйцеклеток, полученных в результате индукции полиовуляции, мужских зигот образуется больше, чем женских;

- в процессе раннего эмбриогенеза в результате нейрогуморальной и биохимической регуляции происходит избирательная отбраковка эмбрионов с нарушениями на генетическом уровне;

- отбраковка эмбрионов с генетическими аномалиями в большей степени происходит среди мужских эмбрионов, как основных носителей таких аномалий;

- после извлечении эмбрионов из матки действие материнского «блока развития» прерывается, что служит толчком к восстановлению тотипотентного развития для частично поврежденных эмбрионов;

- действие «блока развития» у реципиента, или суррогатной матери, не проявляется по отношению к чужеродным эмбрионам, поэтому частично поврежденные эмбрионы в матке реципиента не отторгаются.

Проведенное нами аналитическое исследование не носит характер законченного научного заключения и нуждается в дальнейшем, более глубоком и детальном изучении. Однако, несмотря на спорный характер предлагаемых выводов, некоторые положения уже сейчас могут иметь практическое значение. 

Так, вероятно, извлечение эмбрионов в 6-дневной стадии развития может быть более целесообразным, по сравнению с общепринятым 7-8-дневным.Это позволит избежать воздействие «блока развития» на стадиях роста эмбрионов от ранней морулы до зрелой бластоцисты в условиях вне организма матери. Последующее культивирование полученных эмбрионов в течение 24-36 часов позволит повысить выход качественных эмбрионов за счет дополнительного отбора части мужских эмбрионов, которые получат «второе рождение» в критический период роста и созревания от стадии морулы до бластоцисты.

При желательном получении большего количества бычков следует проводить извлечение эмбрионов у суперовулированных доноров на 6-7-й дни индуцированного полового цикла и отдать предпочтение пересадке морул. При этом в процесс лабораторных работ следует включить процедуру культивирования эмбрионов низкого качества. Напротив, для получения большего количества телочек следует пересаживать преимущественно бластоцисты после извлечения эмбрионов на 8-й день суперовулированного цикла.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бабенков В. Зависимость соотношения полов при трансплантации от стадии развития эмбрионов. // Вет. газ. 1997. № 1 (35).

2. Бабенков В.Ю., Кыса И.С. Детерминация пола и стадии развития эмбрионов при трансплантации. // Матер. Междун. науч.-произв. конф. "Конкурентоспособное производство продукции животноводства в Республике Беларусь". Жодино,1999. С. 79.

3. Бабенков В.Ю. Биотехнологические методы интенсификации воспроизводства молочного и мясного скота: Дис. … д-ра биол. наук: 03.00.23. ВИЖ. Дубровицы, 2004.  234 с. 

4. Брусиловский А.И. Жизнь до рождения. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Знание. 1991. С. 56-60.

5. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Ленинград, 1989. 255 с.

6. Лимонов В.И. современное состояние проблемы иммунных взаимоотношений в системе мать-плод. // Успехи современной генетики. М., Наука. 1985. №13. С. 103-108.

7. Морозов Е.И., Тарасевич Е.И., Анохина В.С. Генетика в вопросах и ответах. Мн.: Университетское. 1989. 288 с.

8. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат. 1989. 302 с.

9. Beatty R.A. Sex determination in farm and laboratory animals: a review. // Vet. Rec. 1972. V. 90. P. 243.